La acción comienza en un planeta en una etapa prebiótica. Al borde de una cascada un extraterrestre humanoide espera mientras una enorme nave espacial, que permanecía inmóvil, empieza a alejarse. El humanoide bebe un líquido negro burbujeante y empieza a desintegrarse. Cuando sus restos corporales caen por la cascada, el ADN del extraterrestre sufre una reacción biogenética.
En 2089, los arqueólogos Elizabeth Shaw y Charlie Holloway descubren un mismo mapa estelar en escrituras de varias antiguas culturas sin contacto entre ellas, interpretándolo como una invitación de los precursores o diseñadores de la humanidad, o «Ingenieros», a visitar un sistema planetario específico señalado en el mapa. Peter Weyland, el anciano fundador y dueño de la Corporación Weyland, reúne fondos para la creación y lanzamiento de la nave científica Prometheus, con el objeto de viajar hasta la luna distante LV-223, la única habitable en el sistema planetario del mapa. La tripulación de la nave viaja en hipersueño mientras el androide David monitorea el viaje y estudia lenguas antiguas, como el protoindoeuropeo, a través de la fábula La oveja y los caballos, e inglés con entonación británica, mediante filmes del siglo XX como Lawrence de Arabia. Llegando al planetoide durante la Navidad de 2093, Shaw y Holloway explican al resto de la tripulación las características de la misión, consistente en encontrar a los Ingenieros. La directora de la misión, Meredith Vickers, les ordena que eviten hacer contacto sin su permiso. Prometheus aterriza cerca de una gran estructura artificial, que una parte del equipo explora.
En los pasadizos de la estructura, frente a una enorme puerta, hallan el cadáver decapitado de un enorme extraterrestre antropomorfo, el cual parece ser un Ingeniero. El geólogo Fifield y el biólogo Millburn, dominados por el miedo, deciden emprender el regreso. David utiliza sus conocimientos de lingüística para descifrar la escritura de la puerta y abrir una vasta cámara abovedada. En el interior encuentran numerosos cilindros similares a ánforas, una estatua monolítica de una cabeza humanoide, y la cabeza cercenada del cadáver del pasadizo. En secreto, David toma un cilindro, mientras de los cilindros restantes empieza a filtrarse un líquido oscuro. Rápidamente una fuerte tormenta se acerca y fuerza al equipo a retornar a la Prometheus. Millburn y Fifield, que se han perdido en el laberinto de pasadizos, quedan atrapados en la estructura. En la Prometheus, Shaw descubre que el ADN del Ingeniero tiene una estrecha relación con el de los humanos. Mientras tanto, David examina el cilindro, del que extrae un líquido negro. Intencionalmente infecta a Holloway dándole a beber disimuladamente la sustancia. Más tarde Shaw y Holloway mantienen relaciones sexuales.
Dentro de la bóveda de los cilindros, una criatura semejante a una serpiente ataca y mata a Millburn. Al intentar ayudarlo, Fifield es rociado por la sangre corrosiva de la criatura, la cual derrite su casco y lo expone al líquido oscuro filtrado de los cilindros. Cuando la tormenta amaina, el equipo regresa a la estructura y encuentra el cadáver de Millburn. Explorando por separado, David descubre un pasadizo hacia una sala de control que contiene a un Ingeniero sobreviviente en hipersueño, y un mapa estelar que resalta la Tierra. Mientras tanto, la infección de Holloway arrasa su cuerpo. El equipo regresa con prisa a la Prometheus para atender a Holloway. Vickers se niega dejarlo ingresar a la nave y Holloway se inmola obligando a Vickers a matarlo quemándolo con un lanzallamas. Más tarde, un escáner médico revela que Shaw, a pesar de ser estéril, está embarazada de una cría alienígena. David intenta retener a Shaw para llevarla a la Tierra y estudiar la cría, pero Shaw escapa. Utilizando una camilla quirúrgica automatizada, extrae la criatura alienígena de su cuerpo. Luego descubre que Peter Weyland ha viajado en hipersueño a bordo de la Prometheus. El anciano acaba de ser despertado por David y sus asistentes, y explica a Shaw que desea preguntar a los Ingenieros cómo prevenir su muerte. Cuando Weyland se prepara para ir a la estructura, Vickers lo enfrenta. En la discusión subsiguiente ella lo llama «padre».
Mientras tanto, Fifield, ahora contaminado y convertido en un monstruo, ataca el hangar de descenso de la Prometheus y asesina a varios miembros de la tripulación, pero logran destruirlo. El capitán de la Prometheus, Janek, especula que la estructura fue parte de una base militar de los Ingenieros, quienes supuestamente perdieron el control de su arma biológica, el líquido negro. Janek también determina que la estructura con la sala de control descubierta por David es, de hecho, una nave espacial en un hangar subterráneo. Weyland y su equipo, incluida Shaw, ingresan a la nave extraterrestre y despiertan al Ingeniero. David habla al Ingeniero en protoindoeuropeo,5 pero éste, en lugar de responder, mutila al androide y mata a Weyland y su equipo. Shaw escapa de la nave, mientras el Ingeniero se prepara para hacerla despegar con la bodega llena de cilindros llenos del fatal líquido oscuro. La cabeza aún activa de David revela a Shaw que el Ingeniero lanzará el líquido en la Tierra. Shaw convence a Janek de detener la nave del Ingeniero. Vickers y su nave salvavidas son eyectados. Entonces Janek estrella la Prometheus contra la nave extraterrestre antes de que esta logre terminar de despegar. La nave extraterrestre, averiada, cae sobre la superficie del planeta, aplastando a Vickers. Shaw corre a la nave salvavidas de Vickers y encuentra a su hijo alienígena, que ha crecido a un tamaño gigantesco, aún encerrado en el quirófano. David advierte a Shaw por intercomunicador que el Ingeniero sobrevivió al impacto y se dirige hacia ella. El Ingeniero aparece en la nave salvavidas y ataca a Shaw. Ella libera su vástago alienígena contra el Ingeniero. Mientras Shaw huye, el monstruo hunde un tentáculo por la garganta del Ingeniero, dominándolo. Shaw recupera los restos de David, y con su ayuda, se lanza en otra nave espacial extraterrestre hacia el planeta natal de los Ingenieros, en un intento de entender por qué crearon a la humanidad y más tarde trataron de destruirla. Shaw envía un último mensaje de advertencia, diciendo que nadie debe acercarse a ese planetoide. La fecha es Año Nuevo de 2094.
Entre tanto, en la nave salvavidas, un ser similar a un xenomorfo brota del pecho del Ingeniero.
